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反射荧光显微镜原理汞灯激发滤色镜分色镜吸收

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  荧光显微镜 王泽剑 上海交通大学药学院 基本知识 荧光的性质 保持固有的荧光特性 荧光波长>激发波长 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率 荧光染色分类: 自发荧光 二次荧光 抗体荧光技术 自发荧光(不加染色) 有些物质不加染色,也能发出荧光(自发荧光或原发荧光),但在医学和生物学领域中,只有很少物质具有自发荧光。 二次荧光(用化学染色) 非荧光性的物质(蛋白质、炭水化合物)用荧光色素染色,由荧光色素产生荧光(二次荧光),以便进行观察。对特定物体选择合适的荧光色素,该物体就能和周围的组织或细胞区别出来而可以观察到。 荧光的种类 抗体荧光技术(用免疫染色) 利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实,有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应,这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。 荧光显微镜的种类 透射式 落射式 荧光的特性(1) 荧 光 的吸收光谱和发射光谱 大致对 称 于 某轴分布 ,形成镜象关系 荧光发出时不 象普通光那样 会产生热 效应 ,它是冷 光 。 荧光的吸收及发射光谱 荧光发光方向与激 发光的方向无关, 它呈 球体辐 射 。 荧光具有偏振性 一、荧光显微镜原理 原理: 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源,经过滤色系统发出一定波长的光作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后,再通过物镜和目镜的放大进行观察。 在强烈的对衬背景下,即使荧光很微弱也易辨认,敏感性高,主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。 荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明,而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本,不是由于光源的照明,而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。 荧光显微镜的基本构造 : 由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。 特点 荧光: 一般采用超高压汞灯(50-200W),它可发出各种波长的光,但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长,所以需加用激发滤片(一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片),仅使一定波长的激发光透过照射到标本上,而将其他光都吸收掉。 滤光片 激发滤光片:紧靠光源 UV:340-380nm 色玻璃 V:390-460nm 种类: B:460-500nm 干涉滤色片 G:500-570nm 截止滤光片:物镜与目镜间 阻断(或压制)滤光片: 吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛。 选择并让特异的荧光透过,表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。 光学系统需完成的功能 荧光显微镜就其光路来分有两种: 1.? 透射式荧光显微镜 激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器,也可用普通集光器,调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上.这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强,而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱.所以对观察较大的标本材料较好。 透射荧光显微镜 汞灯光源 激发滤色镜 暗场聚光镜 吸收滤色镜 透射荧光显微镜原理 透射荧光显微镜的构造 优点: 由于用了暗场聚光镜,激发光不能进入物镜,因此容易形成暗的背景,得到良好的反差。 由于上述同样的原因,任何物镜都可用于观察。 用低倍物镜时,比反射荧光显微镜更亮。 缺点: 必须正确调整聚光镜中心和高度,否则不能获得明亮的荧光像。 由于暗视场聚光镜焦距限制,不能使用厚的载玻片。 视场照明区不能过大,否则容易使荧光标本荧光色衰褪。 厚的或不透明的标本不适用。 2.落射式荧光显微镜: 这是近代发展起来的新式荧光显微镜,与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面,即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器,它与光铀呈45度角,激发光被反射到物镜中,并聚集在样品上,样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜,反回到双色束分离器,使激发光和荧光分开,残余激发光再被阻断滤片吸收。 组成 光源:高压汞灯或卤素灯。 聚光镜:因为物镜作为聚光镜,所以不需要聚光镜。 物镜:所用的物镜必须能透过足够的紫外光,而且本身不产生荧光,对数值孔径没有限制。 标本:厚的标本或不透明的标本都能观察。 汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 反射荧光显微镜原理 反射荧光显微镜的构造 优点: 由于物镜兼作聚光镜,不需要很多调节。 物镜数值孔径不受限制,在高放大被率时,也可以获得高分辨率的像。 厚的或不透明的标本也能观察,厚的盖玻片也能使用。 其它观察法也能与反射荧光结合使用,特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。 缺点: 在用低倍率物镜时,像比较暗,因此必须用大数值孔径的物镜。 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。 激发荧光的方式: 按光的波长范围分为UV激发法(使用紫外线照明法)和BV激发法(使用蓝紫光)两种。 UV激发法是用短于400nm的近紫外光进行激发。该法不存在可见的激发光,所以被观察的荧光呈现该染料固有的荧光,容易判别标本上的特异荧光和背景组织的自身荧光。 BV激发法是以404nm、434nm为中心的由紫外至蓝光进行激发。 该方法使用蓝光照射标本,所以荧光观察系统的截止滤光片必须使用可完全阻断蓝光并可充分通过所需绿、黄荧光的滤光片。 用于荧光抗体法的荧光色素,对于激发光的极大吸收波长和荧光的极大发光波长比较接近,所以BV激发法使用的滤光片必须使用锐截止式滤光片。该法可用蓝光作为激发光,所以荧光色素的吸收效率较高,可得到较明亮的图像。 其缺点是500nm以下的荧光无法看到,而500nm以上的使整个图像显黄色。在荧光抗体法中,大多以荧光色素特有的颜色来判断其特异性,所以在讨论微妙的特异性时,上述BV激发法的缺点往往影响极大。 荧光显微镜的照明可根据聚光器的构造和激发光的波长按以下三点考虑: ? ??? ①从荧光像的反差要求来看,UV激发暗场聚光器照明最好。 ? ??? ②以像的亮度来考虑,BV激发滤光片暗场观察效率最高。? ??? ③UV激发滤光片暗场观察和BV激发暗场聚光器照明的特性,可看作介于这两种照明方法之间,但前者滤光片暗场的性质较强,显示图像较明亮,反差小;后者因保留暗场光路的性质,故显示图像较暗,而反差有所改善。当实际使用荧光显微镜时,应采用最适合标本要求的照明法进行观察。 需要注意,即使像反差最佳的UV激发暗场聚光器照明,由标本折射或散射的部分紫外激发光也会进入物镜,这样在光学系统中的加拿大胶胶合面和光学玻璃因激发引起的自身荧光会使像的反应变坏。因此,必须在目镜前面使用紫外吸收滤光片作为截止滤光片(萤石或氟石玻璃)。 三、使 用 方 法 1.使用显微镜时请保持周围环境的清洁。 2.打开灯源,超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。使用荧光进行观察时,不要频繁的开关荧光电源。开关间断时间要保持在20~30分钟以上。 3.透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片,在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片/双色束分离器/阻断滤片的插块。 4.仪器的所有镜头均经校正,不得擅自拆开,如有灰尘沾在镜头上可先用吹风球将灰尘吹去,再用毛笔拂除。 5.载物台在不使用时不应放置过重的物体,以防止升降机构损坏。 6.用低倍镜观察,根据不同型号荧光显微镜的调节装置,调整光源中心,使其位于整个照明光斑的中央。 7.放置标本片,调焦后即可观察。 使用中应注意:未装滤光片不要用眼直接观察,以免引起眼的损伤;用油镜观察标本时,必须用无荧光的特殊油镜;高压汞灯关闭后不能立即重新打开,需经5分钟后才能再启动,否则会不稳定,影响汞灯寿命。 8.显微镜使用过后,应立即切断电源。并保持载物台的清洁。如使用100X油镜,请在使用后,用清洁液清洗。 清洁液配比,:酒精=7:3 观察荧光: 在示教台上的荧光显微镜下用蓝紫光滤光片,可见经0.01%的丫啶橙荧光染料染色的细胞,细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色) 细胞器染色 激光共聚焦染色 四、注意事项 1.严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序。 2.应在暗室中进行检查,进人暗室后接通高压稳压器电源,开启3~5min后再开启激发高压汞灯,当看到高压汞灯完全亮后,停止激发,再开始观察标本。 3.防止紫外线对眼睛的损害,做实验前将防护屏放下。 4.检查时间每次以1h为宜,超过90min,高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱,标本经激发15min后,荧光亦明显减弱。 5.荧光显微镜的激发装置及高压汞灯寿命有限,标本应集中检查,节省时间;汞灯应避免多次开启,最好避免在半小时内开关。 6.标本染色后立刻观察,因存放时间太久,荧光会逐渐猝灭。可将染好色的标本用黑纸包好,存放在聚乙烯塑料袋中,4℃保存,可延缓荧光的猝灭时间。 7.荧光亮度的判断标准一般为四级,即“一”无或可见微弱自发荧光;“+”仅能见明确可见的荧光;“++”可见有明亮的荧光;“+++”可见耀眼的荧光。 五、维护与保养 1.镜头的清洁 镜头上粘的灰尘应用柔软的刷子轻轻刷掉,在有指纹和油污的地方宜用柔软于净的脱脂棉、纱布或擦镜纸蘸上无水乙醇(或甲醇)轻轻擦拭,对物镜表面上的油渍可以用汽油擦拭。 2.涂漆部分、塑料部分的清洁 对涂漆部分、塑料部分用中性去污剂擦拭,避免使用有机溶剂。 荧光显微镜 下的丝状细菌 汞 灯 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 物 镜 标 本 吸收滤色镜 激发滤色镜 分色镜 汞灯 紫外线保护罩 孔径光栏(FS) 视场光栏(AS) * * 自发荧光 二次荧光 自发荧光:物质受光激发产生的固有荧光 二次荧光:物质借荧光色素受光激发产生的荧光 染 色 不染色 激发光 发射光 30----180nm 光源 目镜 吸收滤色镜 物镜 暗场聚光镜 激发滤色镜 汞灯 吸收滤色镜 暗场聚光镜 激发滤色镜 汞灯箱